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ALKBH5介导的lncRNA DDIT4-AS1上调维持胰腺癌干性的机制

发布时间:2022-09-26

化疗耐药是导致胰腺癌患者预后不良的主要因素,而癌症干性是与化疗耐药相关的最关键因素之一,并且是一个非常有前景的癌症治疗方向。然而,癌症干性的确切分子机制尚未完全阐明。近日,Molecular Cancer(IF41.444)期刊在线发表了一篇题为The m6A demethylase ALKBH5-mediated upregulation of DDIT4-AS1 maintains pancreatic cancer stemness and suppresses chemosensitivity by activating the mTOR pathway的研究型论文。该研究发现ALKBH5介导的m6A修饰导致PDAC中DDIT4-AS1过表达,并且DDIT-AS1通过破坏DDIT4和激活mTOR通路增加癌症干性并抑制对GEM(吉西他滨)的化学敏感性。暗示靶向DDIT4-AS1及其通路的方法可能是治疗PDAC化疗耐药的有效策略。

 

研究结果 

• ALKBH5以m6A依赖性方式调节DDIT4-AS1 

首先,研究人员在ALKBH5过表达或不过表达的细胞中进行MeRIP-Seq(相关测序服务由锐博生物提供),以确定lncRNAs是否被ALKBH5去甲基化,并参与PDAC细胞的恶性表型。结果显示,425个mRNAs和lncRNAs中的m6A水平显著降低,269个mRNAs和lncRNAs中的m6A水平显著增加。此外,通过TCGA-PDAC数据库筛选,研究人员在PDAC患者中发现了140个上调的lncRNAs。比对后发现有2个重叠的lncRNAs,其中DDIT4-AS1很少被研究,被选作后续分析。 

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Fig1. MeRIP-Seq鉴定候选lncRNAs


基于MeRIP-seq结果发现,ALKBH5过表达后DDIT4-AS1上的m6A峰减少。研究人员猜测DDIT4-AS1可能受ALKBH5介导的m6A修饰调控。通过对临床PDAC样本或PDAC细胞系进行检测发现,PDAC组织或细胞系中DDIT4-AS1的表达及其m6A水平高于正常邻近组织或细胞。此外,ALKBH5敲低增加了DDIT4-AS1及其m6A修饰的水平;过表达ALKBH5则产生相反的结果。 

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Fig2. DDIT4-AS1受ALKBH5介导的m6A修饰调控

 

进一步的研究发现,HuR的缺失显著降低了DDIT4-AS1的表达。RIP实验证实了PDAC细胞中HuR和DDIT4-AS1之间的直接相互作用。此外,在ALKBH5过表达后,HuR和DDIT4-AS1之间的相互作用也被破坏。因此,HuR与DDIT4-AS1结合,以m6A依赖性方式增加其表达。

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Fig3. ALKBH5以m6A依赖性方式调节DDIT4-AS1


 

• DDIT4-AS1在PDAC中上调并预测较短的生存期

TCGA和GTEx数据库分析及qRT-PCR检测结果显示,与正常组织相比,DDIT4-AS1在PDAC组织中显著上调。FISH结果证实了DDIT4-AS1主要位于细胞质中,并且DDIT4-AS1的预期大小为847 bp。临床分析显示DDIT4-AS1与肿瘤大小和肿瘤分期呈正相关。Kaplan-Meier分析显示,较高的DDIT4-AS1表达与较低的总生存率(OS)和无病生存率(DFS)相关。

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Fig4. DDIT4-AS1在PDAC中上调并预测较短的生存期

 

 

• DDIT4-AS1维持PDAC细胞的干性特性

为了研究DDIT4-AS1在PDAC干性中的调控作用,研究人员进行了功能获得性和功能缺失性研究。结果显示,DDIT4-AS1敲低降低了体外PDAC细胞形成初级和次级球状体的能力,并且导致小鼠体内肿瘤发生率明显降低,肿瘤生长和体重略有下降;过表达DDIT4-AS1则得到相反的结果。此外,沉默DDIT4-AS1降低了CSC(肿瘤干细胞)标志物的表达;而过表达DDIT4-AS1则增加了CSC标志物的表达。与CSC标志物的结果一致,CD133high PDAC细胞的比例在DDIT4-AS1缺失的PDAC细胞中显著降低,在DDIT4-AS1过表达的PDAC细胞中则显著增加。表明DDIT4-AS1对于维持PDAC细胞的干性特性至关重要。

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Fig5. DDIT4-AS1维持PDAC细胞的干性特性


 

• DDIT4-AS1抑制PDAC细胞对GEM的化学敏感性

接着,研究人员探索了DDIT4-AS1是否调节PDAC细胞的化学敏感性。结果发现,异位抑制DDIT4-AS1可使PDAC细胞对GEM敏感,表现为集落形成能力降低。相比之下,DDIT4-AS1的过表达损害了GEM诱导的集落形成抑制。体内实验显示,使用GEM治疗DDIT4-AS1敲低的小鼠表现出肿瘤重量和肿瘤生长的显著减少。此外,DDIT4-AS1敲低和GEM处理的组合导致Ki67的弱染色和Caspase-3的强染色。以上结果表明,与载体转染的PDAC细胞来源的肿瘤相比,DDIT4-AS1敲低的PDAC细胞来源的肿瘤对GEM更敏感。

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Fig6. DDIT4-AS1抑制PDAC细胞对GEM的化学敏感性


 

• DDIT4-AS1通过激活mTOR通路调节干性和化学敏感性

为了探索DDIT4-AS1调控干性和化学敏感性的潜在机制,研究人员进行了RNA测序、Western blot和生物信息学分析以鉴定DDIT4-AS1的下游通路。结果发现,DDIT4-AS1通过激活mTOR通路促进干性并抑制化学敏感性。进一步的IP、RIP和RNA pulldown实验发现DDIT4-AS1通过阻止SMG5和PP2A与UPF1的结合来促进UPF1的磷酸化,从而降低DDIT4 mRNA的稳定性并激活mTOR通路。

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Fig7. DDIT4-AS1通过激活mTOR通路调节干性和化学敏感性的模型示意图

 

 

• DDIT4-AS1敲低和GEM联合对PDX模型产生协同作用

最后,研究人员在PDX模型中对DDIT4-AS1敲低和GEM联合治疗的疗效进行了体内评估。结果显示,DDIT4-AS1敲低与GEM的组合对肿瘤生长和体重的抑制作用比任何单独的治疗都强。沉默DDIT4-AS1增加了DDIT4表达并降低了p-mTOR表达。此外,与其他组相比,DDIT4-AS1敲低与GEM的组合减少了增殖并增加了细胞凋亡。表明DDIT4-AS1沉默通过DDIT4介导的mTOR通路增加了PDAC细胞对GEM的化学敏感性。

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Fig8. DDIT4-AS1敲低和GEM联合对PDX模型产生协同作用

 

总之,本研究结果发现DDIT4-AS1在PDAC细胞中被ALKBH5和HuR扩增、过表达和稳定。DDIT4-AS1作为癌基因,显著促进PDAC干性并抑制对GEM的化学敏感性。DDIT4-AS1与UPF1物理相互作用并覆盖SMG5和PP2A的结合位点,以促进UPF1磷酸化、DDIT4 mRNA的降解和mTOR通路的激活。在基于PDX的模型中,DDIT4-AS1 shRNA与GEM联合治疗显著增加了PDAC的抗肿瘤活性。DDIT4-AS1的发现为深入了解PDAC的癌变机制提供了线索,并可能促进癌症筛查和治疗的精确方法的开发。

 

原文链接:https://link.springer.com/article/10.1186/s12943-022-01647-0#Abs1